Wynik PhenoAge się zmienił: realna poprawa czy szum laboratoryjny?
Szum laboratoryjny przy zmianie wyniku PhenoAge jest częsty. Dowiedz się, kiedy zmiana prawdopodobnie oznacza realny postęp, kiedy powtórzyć badanie i które biomarkery sprawdzić bezpiecznie.
Twój wynik PhenoAge się zmienił. Może spadł z 52 do 48 po trzech miesiącach lepszego snu i treningu. Może wzrósł z 44 do 49 po stresującej zimie. Oczywiste pytanie jest też tym niebezpiecznym: czy to była realna zmiana biologiczna, czy szum laboratoryjny?
Jeśli pytanie nie jest specyficzne dla PhenoAge, przed zmianą planu skorzystaj z szerszego schematu wzrost wyniku wieku biologicznego.
Jeśli analizujesz niedawny wynik, sprawdź też, czy wiek biologiczny może się zmienić w 90 dni, aby oddzielić realny sygnał od szumu pomiarowego.
Uczciwa odpowiedź brzmi: pojedyncza zmiana PhenoAge rzadko tłumaczy się sama. PhenoAge opiera się na rutynowych markerach krwi, a te markery zmieniają się z wielu powodów: realnych zmian zdrowotnych, przejściowego stanu zapalnego, statusu postu, nawodnienia, ciężkiego wysiłku, różnic w metodach laboratoryjnych i zwykłej biologicznej zmienności u tej samej osoby.
Ten artykuł nie powtarza podstaw wzoru. Jeśli ich potrzebujesz, zacznij od PhenoAge i wieku biologicznego KDM z badań krwi. Tutaj skupiamy się na praktycznym problemie interpretacji: jak zdecydować, czy zmieniony wynik jest prawdopodobnie znaczący, kiedy powtórzyć badanie i które markery wejściowe wymagają uwagi.
Najważniejsze wnioski
- Małe zmiany PhenoAge często są szumem. Przesunięcie o 0-1 rok rzadko wystarcza, aby ogłosić poprawę lub pogorszenie.
- Przyczyna zmiany jest ważniejsza niż sam wynik. Zmiana wywołana jednym zmiennym markerem, zwłaszcza CRP, jest mniej przekonująca niż spójny wzorzec w kilku markerach.
- To samo laboratorium, te same jednostki, te same warunki. Porównywanie różnych laboratoriów albo różnych stanów przygotowania może stworzyć fałszywą poprawę lub fałszywe pogorszenie.
- Kontekst powtórnego badania ma znaczenie. Choroba, ciężki wysiłek, odwodnienie, słaby sen, alkohol i ostry stres mogą przesunąć markery krwi stojące za PhenoAge.
- Szukaj trwałości. Realna poprawa powinna utrzymać się w co najmniej dwóch porównywalnych pobraniach i pasować do szerszych trendów zdrowotnych.
Szybka odpowiedź: jaka zmiana jest znacząca?
Nie istnieje uniwersalny kliniczny próg dla znaczącej osobistej zmiany PhenoAge. Jako praktyczna, niediagnostyczna zasada:
| Zmiana wyniku | Pierwsza interpretacja | Co zrobić |
|---|---|---|
| 0-1 rok | Zwykle szum lub normalna fluktuacja | Nie reaguj przesadnie; sprawdź dane wejściowe |
| 1-3 lata | Możliwie realna, możliwie szum | Sprawdź, które biomarkery się zmieniły i czy warunki były takie same |
| 3-5 lat | Bardziej prawdopodobnie znacząca, jeśli kilka markerów układa się spójnie | Powtórz badanie w standaryzowanych warunkach albo omów wynik z klinicystą |
| Ponad 5 lat | Może oznaczać realną zmianę, ostrą chorobę, błąd jednostek albo błąd wprowadzania danych | Sprawdź jednostki, laboratorium, objawy, leki i wartości poza zakresem |
Kluczowe są słowa „jeśli kilka markerów układa się spójnie”. Spadek o 4 lata wywołany niemal w całości obniżeniem CRP po ustąpieniu przeziębienia różni się od spadku o 4 lata wynikającego z niższej glukozy, niższego CRP, lepszej albuminy, niższej liczby białych krwinek i stabilnych markerów nerkowych w dwóch badaniach.
Dlaczego PhenoAge zmienia się między badaniami
PhenoAge łączy wiek chronologiczny z dziewięcioma biomarkerami klinicznymi: albuminą, kreatyniną, glukozą, białkiem C-reaktywnym, odsetkiem limfocytów, średnią objętością krwinki czerwonej, szerokością rozkładu krwinek czerwonych, fosfatazą alkaliczną i liczbą białych krwinek.
Dzięki temu jest przydatny, bo integruje wiele układów biologicznych. Przez to jest też zaszumiony, bo każdy składnik ma własną krótkoterminową zmienność.
Istnieją trzy szerokie kategorie ruchu:
- Realna zmiana biologiczna. Poprawiłeś zdrowie metaboliczne, zmniejszyłeś przewlekły stan zapalny, wróciłeś do zdrowia po chorobie, zbudowałeś sprawność, straciłeś tłuszcz trzewny, poprawiłeś sen albo leczysz chorobę podstawową.
- Tymczasowa zmienność biologiczna. Byłeś odwodniony, źle spałeś, ciężko trenowałeś, miałeś infekcję, piłeś alkohol, jadłeś inaczej albo zrobiłeś badanie o innej porze dnia.
- Zmienność pomiaru i obsługi próbki. Próbka została inaczej przetworzona, użyto innej metody laboratoryjnej, zmieniły się zakresy referencyjne, jednostki wpisano błędnie albo marker został zaokrąglony.
Wszystkie trzy mogą dać ten sam widoczny rezultat: nową liczbę wieku biologicznego.
Biomarkery PhenoAge, które najczęściej tworzą szum
Nie każdy składnik jest równie zmienny. Niektóre markery mogą szybko się wahać; inne zwykle poruszają się wolniej.
| Biomarker | Częste krótkoterminowe źródło szumu | Dlaczego może zmienić wynik |
|---|---|---|
| Białko C-reaktywne (CRP lub hs-CRP) | Infekcja, uraz, stan zapalny zębów, ciężki wysiłek, zaostrzenie autoimmunologiczne | To marker stanu zapalnego i może gwałtownie wzrosnąć podczas ostrego stresu |
| Białe krwinki | Infekcja, stan zapalny, stres, leki | Aktywacja odporności może wyglądać jak przyspieszony wiek biologiczny |
| Odsetek limfocytów | Niedawna infekcja wirusowa, hormony stresu, przesunięcia odpornościowe | Odsetki zmieniają się, gdy poruszają się inne typy białych krwinek |
| Kreatynina | Nawodnienie, masa mięśniowa, niedawne ciężkie podnoszenie, spożycie mięsa, funkcja nerek | Mała różnica jednostek lub nawodnienia może wpłynąć na interpretację |
| Glukoza | Czas postu, sen, późny posiłek, alkohol, stres, moment ćwiczeń | Jedno poranne pobranie może nie odzwierciedlać zwykłej kontroli metabolicznej |
| Albumina | Nawodnienie, stan zapalny, stan wątroby, status białkowy | Stężenie może przesuwać się wraz z bilansem płynów i stanem zapalnym |
| Fosfataza alkaliczna | Czynniki wątrobowe/dróg żółciowych, obrót kostny, niedawne złamanie, leki | Wymaga kontekstu, bo źródła mogą być różne |
| MCV | Status B12/folianów, alkohol, choroba wątroby, stan tarczycy | Zwykle wolniejsze, ale może ujawniać dłuższy wzorzec |
| RDW | Status żelaza, B12/folianów, stan zapalny, stres szpiku | Często wolniejsze i użyteczne jako marker trendu |
CRP wymaga szczególnej ostrożności. MedlinePlus opisuje CRP jako marker stanu zapalnego powiązany z urazem, infekcją i innymi stanami. Niedawny przegląd systematyczny wykazał wysoką zmienność wewnątrzosobniczą dla CRP i hs-CRP. Oznacza to, że CRP może być klinicznie użyteczne, a jednocześnie słabo nadawać się do stwierdzenia, że jedno powtórne badanie PhenoAge dowodzi trwałej zmiany.
Pierwszy audyt: wyklucz proste błędy
Zanim zaczniesz interpretować biologię, sprawdź dane wejściowe.
1. Sprawdź jednostki
Kalkulatory PhenoAge nie wybaczają błędów. Wpisanie glukozy w mmol/L, gdy kalkulator oczekuje mg/dL, może dać nonsens. Wpisanie kreatyniny w umol/L, gdy oczekiwane jest mg/dL, może zrobić to samo. W raportach w stylu amerykańskim glukoza zwykle jest podawana w mg/dL, kreatynina w mg/dL, albumina w g/dL, ALP w U/L, WBC w 10^3/uL, a CRP może być w mg/L.
Przykłady:
- Glukoza 5,0 mmol/L to około 90 mg/dL.
- Kreatynina 88 umol/L to około 1,0 mg/dL.
- Albumina 45 g/L to około 4,5 g/dL.
Jeśli Twój wynik zmienił się dramatycznie, jednostki są pierwszą rzeczą do sprawdzenia.
2. Potwierdź hs-CRP kontra CRP
CRP wysokoczułe i standardowe CRP są powiązane, ale nie zawsze raportuje się je w ten sam sposób. Niektóre laboratoria ograniczają niskie wartości, inaczej raportują wartości poniżej progu wykrywalności albo używają innej precyzji dziesiętnej. Wartości typu „<0,3 mg/L” nie należy wpisywać jako 3,0.
3. Zweryfikuj odsetek limfocytów
PhenoAge używa odsetka limfocytów, a nie bezwzględnej liczby limfocytów. Wiele wyników laboratoryjnych zawiera oba parametry. Wpisanie niewłaściwego może stworzyć fałszywe przesunięcie.
4. Porównuj ten sam kalkulator
Różne narzędzia online mogą inaczej implementować zaokrąglenia, transformacje logarytmiczne, brakujące wartości albo konwersje jednostek. Do śledzenia trendu używaj za każdym razem tego samego kalkulatora lub aplikacji. To ta sama logika, która stoi za trendem wieku biologicznego kontra pojedynczym wynikiem: spójność wygrywa z nowością.
Nie porównuj też wartości z różnych modeli jak jednej miary: PhenoAge i KDM odpowiadają na odmienne pytania statystyczne.
Drugi audyt: porównaj warunki badania
Jeśli dane wejściowe są poprawne, porównaj warunki wokół obu pobrań.
| Warunek | Dlaczego ma znaczenie | Lepszy standard |
|---|---|---|
| Pora dnia | Glukoza, hormony, nawodnienie i objętość krwi mogą się różnić | Jeśli to możliwe, poranne pobranie |
| Post | Glukoza i lipidy zależą od czasu jedzenia | Stosuj instrukcje klinicysty; często 8-12 godzin przy panelach na czczo |
| Ćwiczenia | Ciężki trening może podnieść markery zapalne i kreatyninę | Unikaj nietypowo ciężkich treningów przez 24-48 godzin przed rutynowymi badaniami śledzącymi |
| Choroba | CRP i białe krwinki mogą zmienić się gwałtownie | Nie używaj pobrania w ostrej infekcji jako punktu odniesienia dla długowieczności |
| Nawodnienie | Stężenia albuminy i kreatyniny mogą się przesuwać | Utrzymaj normalne nawodnienie; nie pij celowo nadmiernie |
| Alkohol i sen | Oba mogą wpływać na glukozę, stan zapalny i markery odpornościowe | Utrzymaj poprzednie 2-3 dni typowe i udokumentowane |
| Laboratorium | Zakresy referencyjne i metody mogą się różnić | Jeśli to możliwe, korzystaj z tego samego laboratorium |
MedlinePlus wyraźnie zastrzega, że wyniki należy porównywać z zakresem referencyjnym na raporcie laboratoryjnym i że trendy łatwiej interpretować, gdy korzystasz z tego samego laboratorium. Programy standaryzacji laboratoryjnej CDC istnieją dlatego, że dokładne, wiarygodne i spójne pomiary nie są automatyczne we wszystkich warunkach.
Tabela decyzyjna: realna poprawa czy szum laboratoryjny?
Użyj tej tabeli po sprawdzeniu jednostek i warunków badania.
| Wzorzec | Bardziej prawdopodobne | Dlaczego |
|---|---|---|
| Wynik poprawił się o 1 rok, wszystkie markery podobne | Szum | Zbyt mała zmiana, aby interpretować ją z pewnością |
| Wynik poprawił się o 4 lata, bo CRP spadło z 8 do 0,8 mg/L | Powrót do zdrowia po ostrym stanie zapalnym albo realna poprawa stanu zapalnego | Wymaga kontekstu: czy byłeś chory przy pierwszym pobraniu? |
| Wynik poprawił się o 3 lata wraz z niższą glukozą na czczo, niższym CRP, niższym WBC i wyższą albuminą | Bardziej prawdopodobnie realne | Kilka układów przesunęło się w korzystnym kierunku |
| Wynik pogorszył się o 3 lata po ciężkim biegu lub bloku podnoszenia ciężarów | Możliwie tymczasowe | Kreatynina, CRP, WBC i glukoza mogą przesunąć się po stresie |
| Wynik pogorszył się o 5 lat, a kilka markerów jest poza zakresem | Wymaga oceny klinicznej | Nie sprowadzaj tego do „starzenia się”; zbadaj przyczyny |
| Wynik nadal się poprawia w 2-3 standaryzowanych badaniach | Bardziej prawdopodobnie trwałe | Kierunek jest spójny mimo normalnej zmienności |
| Wynik skacze w górę i w dół przy każdym pobraniu | Głównie szum albo niestabilne warunki | Ustandaryzuj moment badania i skup się na pojedynczych markerach |
Słowo „prawdopodobne” ma znaczenie. PhenoAge jest szacunkiem fizjologii związanej z ryzykiem, a nie diagnozą medyczną. Jeśli marker jest poza zakresem albo występują objawy, interpretacja kliniczna należy do wykwalifikowanego specjalisty.
Co liczy się jako wiarygodna poprawa?
Wiarygodna poprawa PhenoAge zwykle ma cztery cechy.
1. Jest większa niż oczekiwany przypadkowy ruch
Zmiana o kilka miesięcy nie jest podstawą do działania. Ruch o 2-3 lata może być interesujący, ale tylko jeśli warunki były porównywalne. Większe przesunięcie zasługuje na uwagę, ale nadal wymaga wyjaśnienia na poziomie danych wejściowych.
2. Jest rozłożona na kilka markerów
Najsilniejszy wzorzec to poprawa wielu markerów. Na przykład:
- Glukoza na czczo spada z 5,7 mmol/L (103 mg/dL) do 5,1 mmol/L (91 mg/dL)
- hs-CRP spada z 2,4 mg/L do 0,8 mg/L
- WBC przechodzi z wysokiego zakresu normy do środka normy
- Albumina pozostaje mocna zamiast spadać
- Kreatynina i ALP pozostają stabilne
Taki wzorzec sugeruje szersze przesunięcie statusu metabolicznego i zapalnego. Jeden izolowany marker jest słabszym dowodem.
3. Pasuje do zachowania i fizjologii
Jeśli wynik poprawił się po sześciu miesiącach konsekwentnego treningu, lepszego snu, utraty masy ciała, niższego spożycia alkoholu i poprawy tętna spoczynkowego, historia jest bardziej spójna. Jeśli poprawił się bez żadnej znaczącej zmiany poza tym, że badanie wykonano w innym laboratorium, zachowaj ostrożność.
4. Utrzymuje się
Trwałość jest najsilniejszym osobistym dowodem. Wynik, który utrzymuje się przy kolejnym porównywalnym pobraniu, jest bardziej użyteczny niż dramatyczny jednorazowy spadek.
Jeśli chodzi o czas, zobacz jak często mierzyć wiek biologiczny. Wyniki oparte na krwi mogą zmieniać się szybciej niż zegary metylacji DNA, ale „szybciej” nie oznacza „co tydzień”.
Dlaczego gorszy wynik może nie oznaczać, że starzejesz się szybciej
PhenoAge może się pogorszyć z powodów, które nie są trwałym biologicznym spadkiem.
Możesz zobaczyć gorszy wynik po:
- Infekcji wirusowej albo infekcji zęba
- Ciężkim wydarzeniu wytrzymałościowym albo intensywnym bloku podnoszenia ciężarów
- Tygodniu słabego snu
- Podróży, odwodnieniu, ekspozycji na upał albo alkoholu
- Szybkiej utracie masy ciała z niedostatecznym odżywieniem
- Zmianie leku
- Różnicach laboratoryjnych lub jednostkowych
Niektóre z tych rzeczy nadal warto adresować. Słaby sen i duża ilość alkoholu nie są tylko „szumem”, jeśli są częste. Ale pojedynczego słabego pobrania w stresującym tygodniu nie należy traktować jako dowodu, że tempo starzenia trwale przyspieszyło.
Jest to szczególnie ważne dla osób aktywnych. Budowanie mięśni może lekko podnieść kreatyninę, bo kreatynina odzwierciedla zarówno metabolizm mięśni, jak i filtrację nerkową. Ciężki trening może przejściowo podnieść markery zapalne. Interpretacja tych zmian wymaga kontekstu, nie paniki.
Standaryzowany protokół powtórnego badania
Do rutynowego śledzenia długowieczności używaj powtarzalnego protokołu, chyba że Twój klinicysta zaleci inaczej.
- Jeśli to możliwe, korzystaj z tego samego laboratorium.
- Badaj się rano.
- Za każdym razem stosuj te same instrukcje dotyczące postu.
- Unikaj nietypowo ciężkiego wysiłku przez 24-48 godzin przed pobraniem.
- Nie badaj się podczas ostrej choroby, chyba że badanie jest elementem opieki medycznej.
- Utrzymuj normalne nawodnienie.
- Nie odstawiaj przepisanych leków, aby wynik wyglądał lepiej.
- Zapisz sen, alkohol, ćwiczenia, chorobę, fazę cyklu, jeśli ma znaczenie, i główne stresory z poprzednich 2-3 dni.
- Wprowadzaj jednostki uważnie i zachowaj surowy raport laboratoryjny.
Taka notatka kontekstowa często ma większe znaczenie niż sam wynik. „PhenoAge 47, pobrane po 3 godzinach snu i z bólem gardła” należy interpretować inaczej niż „PhenoAge 47, rano na czczo, normalny tydzień, to samo laboratorium”.
Jak SuperAge pomaga oddzielić sygnał od szumu
SuperAge jest zaprojektowany wokół interpretacji trendów, a nie jednorazowej paniki. Możesz śledzić szacunki wieku biologicznego razem z ich podstawowymi czynnikami: sygnałami z urządzeń noszonych, takimi jak tętno spoczynkowe, HRV, sen, aktywność, VO2 max, oraz markerami laboratoryjnymi, gdy wprowadzasz wyniki krwi.
Użyteczny przepływ pracy jest prosty:
- Użyj wyniku jako nagłówka.
- Użyj biomarkerów napędzających wynik jako wyjaśnienia.
- Użyj trendów z urządzeń noszonych jako kontekstu.
- Użyj powtórnego badania jako potwierdzenia.
Jeśli PhenoAge się poprawia, a HRV, tętno spoczynkowe, sen i aktywność także się poprawiają, historia jest silniejsza. Jeśli PhenoAge się pogarsza, ale dane z urządzenia noszonego są stabilne i po przeziębieniu przesunęło się tylko CRP, historia prawdopodobnie nie oznacza trwałego spadku. Właśnie tutaj łączenie danych krwi i danych z urządzeń noszonych działa lepiej niż każde z nich osobno; nasz przewodnik po wieku biologicznym z badań krwi kontra urządzeniach noszonych wyjaśnia ten kompromis szczegółowo.
SuperAge nie zmienia PhenoAge w diagnozę. Sprawia, że liczbę łatwiej interpretować w kontekście, a właśnie tam śledzenie wieku biologicznego staje się użyteczne.
Co zrobić po zmianie wyniku
Użyj tej sekwencji:
- Sprawdź wprowadzanie danych. Jednostki, typ CRP, odsetek limfocytów i wersję kalkulatora.
- Sprawdź kontekst badania. To samo laboratorium? Ten sam post? Jakakolwiek choroba, ciężki trening, odwodnienie lub ostry stres?
- Zidentyfikuj czynniki napędzające. Które 1-3 biomarkery wyjaśniają większość ruchu?
- Sklasyfikuj wzorzec. Pojedynczy zmienny marker czy przesunięcie wielu markerów?
- Zdecyduj o czasie powtórki. Jeśli warunki były słabe, powtórz badanie za 4-8 tygodni, gdy sytuacja będzie stabilna. Jeśli warunki były dobre, poczekaj 3-6 miesięcy, chyba że klinicysta powie inaczej.
- Działaj na biomarkerach, nie na liczbie wieku. Poprawiaj glukozę, stan zapalny, markery nerkowe, odżywienie albo morfologię na podstawie faktycznych wartości i kontekstu medycznego.
Szerszą listę użytecznych markerów i rytm powtórnych badań znajdziesz w kompletnym przewodniku po badaniach krwi dla długowieczności.
Często zadawane pytania
Czy PhenoAge może zmienić się w trzy miesiące?
Tak, zwłaszcza gdy jest obliczany z biomarkerów krwi, a nie z metylacji DNA. Glukoza, CRP, białe krwinki i albumina mogą zmienić się w ciągu tygodni. Ale nawet trzymiesięczna zmiana wyniku potrzebuje kontekstu, zanim nazwiesz ją realnym postępem.
Czy spadek PhenoAge o 2 lata jest znaczący?
Może być, ale nie jest znaczący automatycznie. Jeśli użyto tego samego laboratorium, tego samego kalkulatora i tych samych warunków badania, a kilka markerów przesunęło się korzystnie, spadek o 2 lata warto potraktować poważnie. Jeśli zmianę wywołał jeden zmienny marker, podchodź do niej ostrożnie.
Czy powinienem od razu powtórzyć badanie, jeśli wynik się pogorszył?
Zwykle nie. Najpierw sprawdź błędy i kontekst. Jeśli byłeś chory, niewyspany, odwodniony albo badałeś się po ciężkim wysiłku, poczekaj, aż sytuacja się ustabilizuje, i powtórz badanie w lepszych warunkach. Jeśli wyniki są bardzo nieprawidłowe albo masz objawy, skontaktuj się z klinicystą zamiast czekać na powtórkę pod kątem długowieczności. Użyj jak wyjaśnić lekarzowi wynik wieku biologicznego, aby przynieść czynniki PhenoAge, a nie tylko sam wynik.
Który biomarker PhenoAge tworzy najwięcej fałszywych alarmów?
CRP to klasyczny marker fałszywego alarmu, bo może skoczyć przy infekcji, urazie, stanie zapalnym zębów albo intensywnym wysiłku. Białe krwinki i odsetek limfocytów także mogą przesuwać się przy stresie odpornościowym. To nie czyni ich bezużytecznymi; oznacza, że potrzebują kontekstu.
Czy powinienem optymalizować zachowanie tylko po to, żeby obniżyć PhenoAge?
Nie. PhenoAge to użyteczna perspektywa, nie cel sam w sobie. Nie odwadniaj się, nie jedz zbyt mało, nie unikaj potrzebnych leków ani nie pomijaj właściwej opieki medycznej, żeby poprawić wynik. Celem jest trwałe zdrowie: lepsza kontrola metaboliczna, niższy przewlekły stan zapalny, zachowana funkcja nerek i wątroby, sprawność, siła i jakość życia.
Najważniejsze wnioski
- Zmieniony wynik PhenoAge jest wskazówką, nie wyrokiem.
- Zacznij od sprawdzenia jednostek, spójności kalkulatora i warunków laboratoryjnych.
- Interpretuj biomarkery bazowe, zanim zaczniesz interpretować liczbę wieku.
- Jeden zmienny marker może stworzyć dużą pozorną zmianę wyniku.
- Trwała poprawa wielu markerów w porównywalnych badaniach jest najsilniejszym sygnałem, że postęp jest realny.
Bibliografia
- Levine, M.E., et al. “An epigenetic biomarker of aging for lifespan and healthspan.” Aging. 2018. https://doi.org/10.18632/aging.101414
- Liu, Z., et al. “A new aging measure captures morbidity and mortality risk across diverse subpopulations from NHANES IV.” PLOS Medicine. 2018. https://doi.org/10.1371/journal.pmed.1002718
- CDC Clinical Standardization Programs. “What is laboratory test standardization?” https://www.cdc.gov/clinical-standardization-programs/about/what-is-standardization.html
- MedlinePlus. “How to understand your lab results.” https://medlineplus.gov/lab-tests/how-to-understand-your-lab-results/
- Gough, A., et al. “Within-subject variation of C-reactive protein and high-sensitivity C-reactive protein: a systematic review and meta-analysis.” PLOS ONE. 2024. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0304961